Проблемы современной системной антимикотической терапии

© Ляшко Андрей Константинович, 2006-2016

ЛЯШКО А.К., к.м.н.

ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ

СИСТЕМНОЙ АНТИМИКОТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОНИХОМИКОЗОВ

            Избирая оптимальную стратегию лечения онихомикоза у конкретного пациента, следует опираться на результаты прямой микроскопии и культурального исследования, поскольку 30-50% клинических диагнозов онихомикоза оказываются неверными. Наиболее трудноразрешимыми проблемами лечения онихомикоза представляют санация ногтевого ложа при системной антимикотической терапии и ростовой зоны ногтя – при местном лечении.

Мировой рынок лечения онихомикоза в 2010 году был оценен в 2 млрд. долларов США, но только 5-20% больных проходят лечение под контролем специалиста.

В настоящее время в лечении онихомикоза используют 4 препарата: итраконазол, тербинафин, флуконазол и гризеофульвин. Но только 3 антимикотика одобрены US Food and Drug Administration для системной антифунгальной терапии: итраконазол, тербинафин, гризеофульвин. Гризеофульвин курьезно запрещен к использованию в России, несмотря на то, что в действительности побочные эффекты препарата сравнительно невелики: головная боль, желудочнокишечные реакции и кожные сыпи¹³. Особенно хорошо переносят лечение гризеофульвином дети. Это препарат выбора в лечении tinea capitis¹³. Более того, гризеофульвин значительно улучшает нутритивный кровоток в артериолах и капиллярах дистальных отделов конечностей, особенно при хронических спастических и атонических нарушениях микроциркуляции. Американские терапевты относят гризеофульвин ко 2-ой группе (всего их 3 – по эффективности) препаратов, использующихся при выраженной ишемии различного генеза^{FitzpatrickTBetal. DermatologyinGeneralMedicine, 1993}.

Минимальные ингибирующие (MIC*) и минимальные фунгицидные (MFC**) концентрации, µg/ml системных антимикотиков для референтных штаммов T. rubrum:

*MIC₅₀ и MIC₉₀ концентрации антимикотиков, ингибирующие рост 50 и 90% колоний (КОЕ), соответственно.

**MFC – простой и довольно точный метод, основанный на подсчете числа оставшихся жизнеспособных колоний (колониеобразующих единиц – CFU) при микроразведении бульона RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute medium) в модификациях протокола CLSI M38-A – соответственно времени инкубации по протоколу MIC^Favre

К несчастью, данные разных авторов существенно различны. Можно сказать с уверенностью, что несмотря на применение общих протоколов, достоверность результатов в области исследований in vitro в известной степени иллюзорна. И уже почти мистической представляется впечатляющая разница в результатах, полученных теми же авторами в разных исследованиях чувствительности к антимикотикам^9,10. Эти любопытные различия следует учитывать при сопоставлении с установленными in vivo данными концентрации антимикотиков в ткани ногтя. К тому же, нет никаких сведений о клиническом значении установления MIC/MFC in vitro²⁶. Поэтому, даже если и будет установлен единый превосходный регламент  –  простой и легко воспроизводимый, много лучше существующих протоколов CLCI – это будет все так же виртуально, как и теперь.

Имеющиеся данные фармакокинетики системных антимикотиков в определенной степени оптимистические. Так, концентрация тербинафина и итраконазола в проксимальной части ногтевой пластинки при стандартных схемах приема нарастает довольно быстро. Эффективные концентрации (экстраполируя in vitro данные) создаются к концу 2 недели^{12,18, 20}. Однако, концентрация тербинафина в дистальных отделах ногтя увеличивается крайне медленно, достигая максимума в 1,0 μg/ml не ранее 18 недели от начала лечения⁶⁴. Для ингибиции референтного штамма T. rubrum MRL666 такой концентрации антимикотика недостаточно даже in vitro. К тому же, никто не обнародовал концентрации антимикотиков в глубоких конусовидных эпителиальных отростках ногтевого ложа, в дерматофитомах, в очагах реактивной гиперплазии соединительной ткани. Именно санация ногтевого ложа представляет наибольшую сложность ввиду неблагоприятных особенностей гистопатологических изменений этой части аппарата ногтя.

По данным Debruyne и Coquerel (2001) время половинной элиминации итраконазола из ногтей составляет от 32 до 147 дней, тербинафина – 24 to 156, флуконазола –50 to 87, что следует учитывать при контрольных исследованиях излеченности. Все три препарата взаимодействуют с энзимами цитохрома P450 (CYP), являясь их потенциальными ингибиторами. Это следует учитывать при одновременном назначении других системных препаратов, поскольку их концентрация в сыворотке крови может возрасти. Итраконазол ингибирует CYP3A4, флуконазол – CYP3A4, CYP2C9 и CYP2C19, тербинафин – CYP2D6¹². Следует иметь в виду, что возможности системной антифунгальной терапии у пожилых людей (а именно они и составляют большинство пациентов) могут быть серьезно ограничены межлекарственными взаимодействиями^{LooDS. Onychomycosisintheelderly: drugtreatmentoptions. DrugsAging2007; 24: 293–302.}. Итраконазол приводит к полному истощению запасов эргостерола путем воздействия на грибковый фермент липостериндеметилазу, зависимую от цитохрома Р-450. Канадская компания MethylGene Inc. разработала MGCD290, небольшая молекула которого ингибирует гистоновую Hos2 диацетилазу ряда грибов, ингибируя транскрипцию генов, вовлеченных в синтез эргостерола. MGCD290 потенцирует действие антимикотиков-азолов, преодолевая резистентность малочувствительных и нечувствительных к азолам штаммов, включая C. glabrata и C. krusei, Aspergillus spp. В сентябре 2010 года была закончена 1 фаза клинических исследований. Препарат в суточной дозе 100-540 мг в сочетании с терапевтическими дозами азолов признан безопасным и эффективным.

J Am Acad Dermatol. 1997 Feb;36(2 Pt 1):173-7.

Itraconazole therapy is effective for pedal onychomycosis caused by some nondermatophyte molds and in mixed infection with dermatophytes and molds: a multicenter study with 36 patients.

De Doncker PR, Scher RK, Baran RL, Decroix J, Degreef HJ, Roseeuw DI, Havu V, Rosen T, Gupta AK, Piérard GE.

К сожалению, обнадеживающие результаты тестирования чувствительности in vitro слишком часто не соответствуют клинической эффективности антимикотиков. Следует признать, что реальная практика дает до половины неудачных результатов лечения, как для тербинафина, так и для итраконазола. Эффективность лечения флуконазолом не дотягивает и до 40%.  Рецидивы инфекции являются поистине “проклятием” терапии онихомикоза. Нередко пациенты остаются невылеченными в условиях оптимальной по длительности системной терапии, причины неудач неочевидны. Оптимистическое заявление Evans и Sigurgeirsson, тиражированное British Medical Journal, о том, что “грибковая болезнь ногтей излечима”^Evans верно, строго говоря, лишь в том смысле, что около половины пациентов, принимающих тербинафин, обнаруживает полное выздоровление по истечении 72 недель с начала лечения. По этому случаю Fred Kavalier резонно замечает: “Разве не было бы так же справедливо (хотя и более пессимистично и, разумеется, менее презентабельно) заявить, что “грибковая болезнь ногтей неизлечима”?^FredKavalier Более того, согласно Hay R и Baran R (2004), так сказать, генералам онихологии, грибковая инфекция ногтей носит отчетливый инвазивный (pervasive) характер. Исследователи недвусмысленно заявили, что в некоторых случаях рецидивы дерматофитных онихомикозов обусловлены повторным лимфатическим заносом грибов из сторожевых (региональных) лимфоузлов^{Hay R, Baran R. COULD NOT PWSO BE A COMPLICATION OF SYSTEMIC DISEASE ? Current Opinion in Infectious Diseases 2004; 17:77-99.}

В зависимости от концентрации антимикотика и свойств грибкового изолята препарат может быть и фунгицидным, in vitro (агент рассматривается как фунгицидный, если отношение  MFC к MIC меньше или равно 4. Однако, нет исследований, подтвердивших клиническое значение блестящих лабораторных показателей. Призрачная фунгицидность тербинафина, развивающаяся в отношении дерматомицетов in vitro в течение 7 часов, является предметом гордости его адептов²⁶.

Но человек не пробирка – несмотря на неоднократно подтвержденную фунгицидность тербинафина в отношении дерматомицетов в рамках стандартного NCCLS (National Commmittee for Clinical Laboratory Standards, теперь – CLSI) исследования, излечение онихомикоза стоп требует кратно более длительного приема антимикотика, чем заявлено в аннотации препарата.

В одном замечательном исследовании⁵³ порошок человеческого ногтя был инокулирован T. rubrum и инкубирован в среде, не поддерживавшей рост дерматофита сама по себе (RPMI 1640 salt medium – т.е. в некотором далеком приближении in vitro были осуществлены условия реальной инфекции). Был получен экстенсивный и инвазивный мицелиальный рост. Культуры продолжали инкубировать до 4 недель, антимикотики добавлялись в различных концентрациях. Было разумно решено оценить  MFC, как 99.9% элиминацию сохранивших жизнеспособность грибов, поскольку определение только такого показателя имеет значение для полного выздоровления пациента, а не пробирки. MFC тербинафина после одной неделе инкубации составила 4 μg/ml, уменьшившись до 1μg/ml после 4 недель. Показатель MFC, полученный по стандарту NCCLS, составил менее 0.03 μg/ml. Исследователи сделали вывод, что инвазивный рост T. rubrum сам по себе является протективным фактором, защищающим гриб от губительного действия антимикотиков.

К тому же, весьма очевидно, что на фоне лечения гриб избирательно растет в области ногтя с меньшей концентрацией  антимикотика или вовсе прекращает рост, прекращая синтетическую деятельность и пережидая неблагоприятные условия (resting fungi). Те же изоляты T. rubrum и T. mentagrophytes в отсутствие роста (стадия покоя – rest period) потребовали в 1000 раз более высокой концентрации тербинафина (2.0 против 0.002 μg/ml) для полного их уничтожения, чем в фазе роста⁶⁹.

Таким образом, если концентрация антимикотика в тканях ногтя снижается до уровня менее MIC данного патогена, может наступить активизация покоящихся в ногтевом ложе грибов и клинический рецидив онихомикоза.

Можно сделать важный вывод: фунгистатический или фунгицидный, для полного гарантированного излечения тотального дистрофического онихомикоза большого пальца стопы системный антимикотик нужно принимать не менее 10-12 месяцев – срок, определяемый минимальным временем полного отрастания ногтевой пластины⁶⁹. Конвенциональные сроки системной терапии недостаточны, в особенности для лиц с низкой скоростью отрастания ногтей и нарушениями периферического кровообращения.

В ряде случаев клинические изоляты T. rubrum обнаруживают MIC, в тысячи раз превосходящую обычную. Такие штаммы перекрестно-резистентны ко всем ингибиторам скваленэпоксидазы, но чувствительны к азолам^46,54. Лечение тербинафином в таком случае неэффективно даже в течение полугода и более ⁴⁶. Нечувствительность к тербинафину наиболее вероятно обусловлена миссенс (точечной) мутацией в гене скваленэпоксидазы, ведущей к замещению аминокислоты F397L⁵⁴. В таких случаях терапия антимикотиками вовсе неэффективна, хотя бы и длилась годы. К слову сказать, сквален нередко добавляют в вакцины для усиления их действия, пренебрегая хорошо известными сведениями о том, что сквален индуцирует развитие системных аутоиммунных заболеваний и дистресс-синдрома^{http://www.autoimmune.com/GWSGen.html}. При длительном приеме тербинафина сквален может быть токсичен не только для грибковых клеток (что и является целью терапии), но и для макроорганизма, уровень сквалена в организме, по-видимому, возрастает. Отмечены случаи возникновения системной красной волчанки или резкого обострения ее течения при лечении онихомикоза тербинафином^{CallenJetal. Subacute Cutaneous Lupus Erythematosus Induced or Exacerbated by Terbinafine. Arch Dermatol. 2001;137:1196-1198.}.

Так же сомнительны в отношении клинической ценности, как и протоколы CLSI, поражающие воображение методики определения концентрации антимикотиков в ткани ногтя – жидкостная хроматография, комбинированные газовая хроматография – масс-спектроскопия⁶⁴, способные дать только призрачную, более чем гадательную оценку шансов на выздоровление.

Факты говорят о том, что даже при создании средних фунгицидных концентраций антимикотика в ногтевой пластинке, особенности анатомии аппарата ногтя и гистопатологии инфицированного ногтя создают относительно защищенные области для персистенции и рецидивирования онихомикоза даже при кажущихся оптимальными схемах лечения, что и наблюдается во многих случаях¹⁸. Несмотря на предварительные оптимистические прогнозы и даже победные реляции, кризис системной антимикотической терапии очевиден. По объективным данным, 25-40% всех клинических случаев онихомикоза классифицированы в качестве провала лечения (treatment failures)²⁵.

Лучшие показатели клинического и микологического выздоровления получены при комбинированной терапии онихомикоза: не только системной, но и активной местной, усиливающей фунгицидность, расширяющей спектр воздействия, сокращающей сроки лечения, повышающей безопасность³⁷.

У больных онихомикозом функциональное состояние сосудов микроциркуляторного русла находится в прямой зависимости от возраста пациентов, продолжительности болезни и площади поражения ногтевой пластинки^{Васенова В.Ю. Иммунопатогенез, морфофункциональная характеристика, клиника, комплексная терапия и профилактика онихомикозов. Автореферат диссертации. Специальность: 14.00.36 Аллергология и иммунология. 2008 г.} . На тонус и реактивность периферических и, особенно, акральных сосудов громадное влияние оказывает состояние иерархически главенствующих структур вегетативной нервной системы – специализированных структур ствола мозга и гипоталамуса, ряда базальных ядер головного мозга. Поэтому существенную, пусть и дополнительную роль в успешном лечении онихомикоза, играют не только сосудистые препараты (пентоксифиллин, добесилат кальция, диосмин), но и вегетокорректоры центрального действия, например, тофизопам и производные 2-меркаптобензимидазола. Введение в комплексную терапию наряду с системными антимикотиками ангиопротекторов и вегетокорректоров повышает эффективность лечения^{ЛяшкоАвтореферат}.

Адъювантная терапия, направленная на улучшение трофики, ускорение роста ногтей, иммуномодуляцию может иметь ключевое значение при замедленном отрастании ногтевых пластин. Скорость роста ногтей определяется скорее генетически, хотя и состояние кровообращения играет существенную роль. Местно и системно могут быть использованы депротеинизированные гемодериваты, например, Актовегин™, препараты денатурированных нуклеиновых кислот, например, натрия дезоксирибонуклеат – Деринат™. Высокоэффективны местные и ряд общих физиотерапевтических процедур, в том числе транскраниальная стимуляция, восстанавливающая физиологический синтез эндогенных опиоидов (эндорфина) и устраняющая разбалансированность вегетативных реакций, последствия дистресс-синдрома. Перспективным направлением является использование методик активного оксигенирования области ногтевого валика озоносодержащими смесями – мощными стимуляторами микроциркуляции и клеточных иммунных реакций.

Теоретически, одновременное назначенение с пероральными антимикотиками системной энзимотерапии (wobenzime, wobe—mugos и т.п.) может быть полезным ввиду возможного ускорения создания необходимых концентраций антимикотиков в ‘проблемных зонах’ аппарата ногтя благодаря более успешному преодолению тканевого барьера, Т-клеточного иммуномодулирующего действия и благоприятного воздействия на кровоснабжение и лимфатический отток. Однако, не удалось найти сведений о проведенных исследованиях эффективности такой терапии.

По мнению большинства исследователей, пожилой и преклонный возраст и связанные с ними выраженные расстройства кровообращения, особенно облитерирующие заболевания периферических артерий, статистически являются главной причиной рецидивов онихомикоза после проведения конвенционального лечения системными антимикотиками. Гипоксия тканей ногтя, замедленный рост ногтей – причина провала элиминации патогенных грибов из ногтевого ложа. Поскольку итраконазол ускоряет рост ногтей, он является очевидным выбором в лечении онихомикоза у пожилых людей. По ряду данных, итраконазол увеличивает скорость отрастания ногтей и успешно применяется в лечении ряда неинфекционных дистрофий, например, синдрома желтых ногтей^{http://www.dermnet.org.nz/hair—nails—sweat/yellow—nails.html.}. В таких случаях итраконазол обычно комбинируют с приемом витамина Е^{TostiA, PiracciniBM, IorizzoM. Systemicitraconazoleintheyellownailsyndrome. BrJDermatol 2002; 146: 1064–7.}. Лечение итраконазолом может значительно ускорять отрастание ногтевой пластинки – возможно, по причине антиоксидантного действия итраконазола и его метаболита – гидроксиитраконазола^{Guerra L. et al. (1997) Effects of itraconazole on in vitro cultered nail matrix keratinocytes. Australian Journal of  Dermatology 36 (Suppl. 2), 283}.

Ускоренный рост ногтей, сочетающийся с развитием характерных изменений текстуры ногтевых пластинок (longitudinal beading) наблюдается при режиме пульс-терапии (400 мг в сутки в течение недели ежемесячно), но отсутствует при постоянном приеме итраконазола по 200 мг в сутки^{de Doncker P., Pierard G. E. Acquired nail beading in patients receiving itraconazole—an indicator of faster nail growth? A study using optical profilometry. Clinical and Experimental Dermatology 19, 404-406}. Возможно, longitudinal beading и являются причиной более низкого (ошибочно заниженного), по сравнению с тербинафином, показателем клинической излеченности в некоторых исследованиях – при статистически равных показателях общей эффективности (overall assessment rates) лечения^{Arca E et al. An open, randomized, comparative study of oral fluconazole, itraconazole and terbinafine therapy in onychomycosis. JDermatologTreat. 2002 Mar;13(1):3-9.}.

ГИСТОПАТОЛОГИЯ ОНИХОМИКОЗА ОПРЕДЕЛЯЕТ

НЕУДАЧИ СИСТЕМНОЙ ТЕРАПИИ?

Наиболее клинически значимыми гистопатологическими изменениями являются подногтевой гиперкератоз ногтевого ложа с формированием глубоких эпителиальных отростков, иногда достигающих зоны надкостницы, и выраженный инвазивный рост гифов, нередко распространяющийся и на соединительную ткань (по мнению Пархоменко и Потекаева, еще и на костную)^{Parkhomenko IuG. Pathohistological characteristics of dermatophytic onychomycosis Arkh Patol. 2001 Jul-Aug;63(4):51-4.} , сопровождающийся образованием кистозных образований ^{Parkhomenko IuG. Pathohistological characteristics of dermatophytic onychomycosis Arkh Patol. 2001 Jul-Aug;63(4):51-4.}  и дерматофитом глубоко в шиповатом слое ногтевого ложа. Воспалительные явления в большинстве случаев выражены слабо, отражая низкую иммуногенность T. rubrum.

В одном из исследований эффективности и безопасности тербинафина в лечении онихомикоза при среднем возрасте пациентов в 69 лет полное излечение (complete cure) было достигнуто только в 28% случаев (48 неделя); наиболее частыми побочными эффектами были тошнота (4,0%), синусит (4,0%), артралгия (2,7%) и гиперхолестеролемия (2,7%). Показатель микологического излечения составил 64,0%, клинического – 41,3%. Показатели полного и клинического излечения были достоверно выше в группе, получавшей адъювантные аппаратные подчистки (debridement) ногтевого ложа^{TavakkolA, FellmanS, KianifardF. Safetyandefficacyoforalterbinafineinthetreatmentofonychomycosis: analysisoftheelderlysubgroupinImprovingResultsinOnychomycosisConcomitantLamisilandDebridement (IRONCLAD), anopen—label, randomizedtrial. AmJGeriatrPharmacother2006; 4:1–13.}. Следует еще раз отметить, что для полного замещения ногтевой пластины стопы может потребоваться 12-18 месяцев, поэтому временным критерием излеченности является скорее срок в 72 недели, а не 48 или 54. Иногда также бывает сложно отличить рецидив от реинфекции.

Гистологические исследования выявили интереснейший феномен, связанный скорее с экстрацеллюлярой синтетической, чем литической активностью дерматомицетов: нередко под ногтевой пластинкой формируется мощный гиперкератотический узел, основание которого покоится в толще ногтевого ложа, содержащий располагающиеся тесно друг к другу множественные агрегации гифов, выглядящие не вполне обычно, имеющие толстую клеточную стенку – дерматофитома^{RobertsDT, EvansEG}. Roberts D и Evans E указывают, что дерматофитома так же затрудняет лечение, как и аспергиллома. Довольно далекая ассоциация, учитывая наиболее частое нахождение аспергиллом в легких и придаточных пазухах носа. Гистопатология тоже различна. Аспергиломы (разновидность мицетомы) характеризуются наличием гиалинового эозинофильного материала, обнаруживаемого среди и вокруг очагового скопления гифов, содержащего преимущественно протеиновый детрит тканей хозяина и иммуноглобулины. Жизнеспособность обычно сохраняют только наружные гифы, кончики которых покрыты избытком ярко-эозинофильного материала (феномен Splendore-Hoeppli). Подобные грибковые шары могут образовать также Zygomycetes и Fusarium. Феномен Splendore-Hoeppli (ярко-эозинофильный матерал по периферии скопления бактерий) характерен и для псевдомицетом, вызываемых Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, оппортунистической Nocardiae и другими бактериями. При дерматофитомах скопления гифов изолированы от окружающих тканей плотной полисахаридной капсулой, четко выявляемой при соответствующей окраске (альциановым голубым, ШИК, толуидиновым синим). По нашему мнению такая гистопатология скорее напоминает капсулы Cryptococcus neoformans.

Другие авторы характеризуют дерматофитомы как особые инфекционные очаги в виде изолированных беловатых^{Burkhart CN} или желтых^{TostiA, PelusoAM} зерен/гранул, четко очерченных, плотных непросвечивающих фунгальных масс^{Burkhart CN}, располагающихся в ногевой пластинке или ногтевом ложе, нечувствительных или малочувствительных к антифунгальной терапии.

Дерматофитомная агрегация гифов продуцирует особый экстрацеллюлярный матрикс, окутывающий инфекционный очаг малопроницаемой полисахаридной биомембраной (biofilm). Предполагают несколько механизмов, объясняющих резистентность грибов внутри полисахаридной капсулы, включая предсказуемую замедленную пенетрацию антимикотиков внутрь очага и замедленный рост изолированных мембраной микроорганизмов^DonlanRM. Естественно предположить, что выраженное снижение поступления питательных веществ и падение оксигенации внутри дерматофитомы вынуждают грибы максимально замедлить процессы клеточного обмена, прекратить рост и перейти в состояние покоя, становясь неуязвимыми для антифунгальных средств, точкой приложения которых являются различные точки роста/ферментные системы грибковой клетки. Грибы сохраняют свои патогенные свойства и по прекращении лечения вновь активизируются. Ряд авторов полагает, что именно исследование свойств этих биомембран определит новые цели антифунгальной терапии, включая разработку агентов, редуцирующих прикрепительные/адгезивные свойства патогенов и их способность к синтезу экстрацеллюлярного матрикса, обладающих выраженной способностью пенетрировать через полисахаридный матрикс^BurkhartCN.

Феномен персистенции дерматофитом соответствует независимой от исследований изолированных биомембранами очагов гипотезе Seebacher C о наличии в пораженном ногте участков мицелиального покоя. В уже упомянотом исследовании Seebacher C (1998), те же самые штаммы T. rubrum и T. mentagrophytes в состоянии покоя (rest period) потребовали в 1000 раз более высокой концентрации тербинафина для уничтожения гриба, чем в фазе роста (2,0 vs 0,002 мкг/мл). Автор полагает, что часть гифов в инфицированном ногте может находится в состоянии покоя, а поскольку “спящие” грибы не вызывают визуализируемого поражения ногтя, то за констатацией клинического выздоровления в дальнейшем следует рецидив ОМ. Автор делает вывод о явной недостаточности стандартного 3-месячного приема тербинафина для существенной части пациентов^SeebacherC. Анализируя результаты, полученные Seebacher C, следует отметить и то, что как такового понятия периода или фазы покоя для культур грибов в отечественной микологии не существует. Такое состояние описывается в терминах депрессии или полного подавления роста при культивации на обедненных или ноль-средах, или при воздействии абсолютно неблагоприятных химических и физических факторов на культуру.

Для выяснения возможных причин неудовлетворительных результатов лечения больных системными антимикотиками Osborne C et al.(2004) предприняли исследование фунгицидных свойств антимикотиков на модели, наиболее приближенной к условиям реальной инфекции. Измельченные в порошок ногтевые пластинки волонтеров были инокулированы стандартным штаммом T. rubrum и инкубированы в жидкой солевой среде RPMI 1640, по мнению авторов, самостоятельно не поддерживающей рост дерматофитов. Таким образом был получен не просто рост культуры, а выраженный и инвазивный мицелиальный рост, подобный  естественному при поражении ногтя. Антимикотики добавлялись в различных концентрациях и культуры инкубировались от 1 до 4 недель. Выживание грибов устанавливалось по признаку распространенного роста культур на картофельном декстрозном агаре (PDA plates) в отсутствие антимикотика и подсчетом колониеобразующих единиц (CFU). Активность антимикотика оценивалась по параметру ногтевой минимальной фунгицидной концентрации (Nail—MFC), необходимой для элиминации 99,9% жизнеспособных грибов. Nail—MFC тербинафина составила 4 мкг/мл после недели инкубирования, снизившись до 1 мкг/мл после 4 недель эксперимента, что было несравнимо выше установленного показателя МФК стандартногомNCCLS анализа (МФК < или = 0,03 мкг/мл). Представляется, что инвазивный мицелиальный рост гриба в ногте сам по себе  защищает T. rubrum от фунгицидного действия системных антимикотиков, определяя необходимость длительного (до года) курсового лечения онихомикоза^{OsborneCSetal. Antifungal drug response in an in vitro model of dermatophyte nail infection. MedMycol. 2004 Apr;42(2):159-63.}.

Несмотря на известные убедительные данные существования драматических особенностей грибковой инфекции ногтя in vivo, обусловливающих неудачи терапии онихомикоза, большинство исследователей по-прежнему уверено, что лишь возраст пациента и влекомые им нарушения кровообращения являются едва ли не единственной причиной провала лечения^{17,22,66,67,73} .