© Ляшко Андрей Константинович, 2006-2016
ЛЯШКО А.К., к.м.н.
ОСОБЕННОСТИ МИКОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
ОНИХОМИКОЗА – ВЗГЛЯД КЛИНИЦИСТА.
Роль микологической диагностики при онихомикозе трудно переоценить, особенно с учетом роста числа рефрактерных дерматомикозов, часто вызываемых мицелиальными недерматомицетами. Хорошо известно, что онихомикоз нельзя диагностировать, основываясь только на клинических признаках. По сообщению Staats C и Korstanje M, микологическое подтверждение при клинически заподозренном онихомикозе было получено только в 60% случаев исследования материала ногтей кисти и 45% – ногтей стоп репрезентативной выборки пациентов18.
Дистальная часть ногтевой пластины перед взятием материала для анализа должна быть обрезана или счищена фрезой. Область ногтя обязательно должна быть тщательно вытерта спиртовыми шариками для удаления контаминантов. Взятие патологического материала при сложных диагностических случаях может производиться при помощи аппарата для медицинского педикюра с дальнейшей классической гистологической проводкой (парафин, нарезка, окрашивание, микроскопия). По ряду данных, например Chang A et al. (2007)Chang A, Wharton J, Tam S, Kovich OI, Kamino H. A modified approach to the histologic diagnosis of onychomycosis. JAmAcadDermatol. 2007 Nov;57(5):849-53, нет настоятельной необходимости биоптировать ноготь пробойником (punch biopsy), достаточно исследовать подногтевой гиперкератоз и детрит: в 97% случаев обнаруживается мицелий, лишь в 3% случаев мицелий выявляют только в самой пластине. Грамотное взятие материала фрезой способно разрешить большинство “проклятых” вопросов диагностики онихомикозов.
Притчей во языцех давно стала низкая чувствительность культуральной диагностики. Между тем израильский исследователь Shemer (2009) сообщает, что в чувствительность разовой культуральной диагностики плесневых грибов составляет не менее 75%!ShemerAetal. Comparative study of nail sampling techniques in onychomycosis. J Dermatol. 2009 Jul;36(7):410-4. По-видимому, материал забирался не кюреткой, а фрезой (в данной статье сведений нет, но методика описана в другой). С другой стороны, около 10% всех пациентов, отобранных Shemer для II и III фаз исследования, вдруг совершенно выздоровели спонтанно. Что за чудеса, ведь заболевание было подтверждено клинически, микроскопически и культурально. Наверное, имела место контаминация. Но все равно, результат поразительный. Также и Summerbell сообщает, что чувствительность прямой микроскопии (первые образцы, initial specimen, материала ногтя) составила для дерматофитов и мицелиальных недерматофитов (NDF), соответственно: 73,8% и 67,2%, культуральной диагностики – 74,6%! в обеих группах. Чувствительность микологической диагностики недерматофитов (тандема методов) составила, таким образом 83,9%SummerbellRCetal.Onychomycosis: a critical study of techniques and criteria for confirming the etiologic significance of nondermatophytes.Med Mycol. 2005 Feb;43(1):39-59..
В некоторых отечественных “референтных” лабораториях в большинстве случаев не растут даже дерматофиты – при повторных положительных результатах прямой микроскопии, чувствительность культурального метода не превышает 25%. Среди лабораторных микологов нет ясного понимания практического использования селективных сред в дифференциальной диагностике онихомикоза. Как в действительности работает циклогексимид (актидион), какие существуют нюансы, важные особенности – нет отработанной алгоритмики, уверенности исследователя.
Известный миколог Gupta A упоминает о постулатах Коха, как о важной отправной точке диагностики инфекций ногтей. Однако сам Кох, как известно, значительно видоизменил собственные постулаты, столкнувшись с реалиями клинической эпидемиологии. Постулаты Коха (постулаты Коха-Пастера) – ряд утверждений, которые можно сделать относительно микроорганизма, из которых следует, что последний является возбудителем некоторой болезни:
Микроорганизм постоянно встречается в организме больных людей (или животных) и отсутствует у здоровых;
Микроорганизм должен быть изолирован от поражённого животного и его штамм должен быть выращен в чистой культуре;
При взаимодействии с препаратом (культурой) микроорганизма, здоровый человек (или животное) заболевает;
Микроорганизм должен быть повторно изолирован от экспериментально заражённого животного.
Заметим, однако, что Кох полностью изъял вторую часть первого постулата, обнаружив бессимптомных носителей холеры (Koch, 1893) и позже – тифа.
Третий постулат не всегда имеет место, как это обнаружил сам Кох у туберкулёза и холеры (Koch, 1884). Действительно, сегодня можно констатировать, что индивиды, лишённые гена CCR5 Δ32, как принято считать, стойки к ВИЧ-инфекции.
В целом, постулаты Коха по сей день все же не потеряли своей значимости и остаются основополагающими принципами микробиологии и инфектологии, соответствие которым является необходимым условием обоснования гипотезы инфекционной этиологии какого-либо заболевания.
Однако, по мнению Summerbell R, в отношении онихомикоза можно выделить шесть различных экологических категорий изолятов недерматомицетов, полученных из материала ногтя41:
1) Контаминанты (рост в лабораторных условиях из неактивных в отношении ногтя спор/конидий, случайная находка, артефакт). Контаминация в отсутствие доказательств патогенности гриба может указывать также на несоблюдение регламента исследовательской методики (некачественный забор материала, нарушение условий его доставки, обсемененность лаборатории и т.п.)
2) Комменсалы кожи в норме
3) Транзитная сапробная колонизация (колонизация без инвазии)
4) Персистирующая вторичная колонизация (только на фоне поражения дерматомицетами, не поддерживается по элиминации последних)*
5) Вторичная инвазия (вызывают поражение ногтя при условии предшествующего повреждения тканевого барьера первичным патогеном, травмой, при вросшем ногте, неинфекционной ониходистрофии)
6) Первичная инвазия (достаточно вирулентные грибы, способные инфицировать и вызвать онихомикоз, здорового, неколонизированного прежде ногтя
*Между тем, известно замечание Н.Д. Шеклакова о том, что выделение недерматомицета вместе с дерматомицетом не дает основания для исключения возможного этиологического значения первого. В части случаев персистенция плесневых грибов и после полноценного курса лечения и элиминации дерматомицетов сохраняется42. Среди отечественных ученых существует и иное мнение: “Дрожжи и микромицеты (плесени) должны рассматриваться как условно-патогенная микрофлора. Первичное поражение ногтей вызывают дерматомицеты, дрожжи и микромицеты колонизируют пораженные ногти вторично”43. Каково мнение ведущих зарубежных исследователей? Summerbell R полагает, что значение Candida как возбудителя онихомикоза per se преувеличено41, 45. По данным Gupta A и Summerbell R (2000), только 1,7% онихомикозов в Канаде вызваны дрожжеподобными грибами44. Summerbell R также сообщает (1989), что 3,3% онихомикозов в Канаде недерматомицетами (NDF)45. По мнению Elewski B (1997) плесневые грибы являются возбудителями 8% онихомикозов в США46. Несмотря на результаты многих исследований, однозначно подтверждающие самостоятельную этиологическую роль Scopulariopsis brevicaulis и Scytalidium dimidiatum, Gupta A et al. (2003)47 все же полагают, что эти плесневые грибы преимущественно вторично колонизируют ногти (оппортунистический онихомикоз47), уже пораженные дерматомицетами. По данным крупного исследования Mügge C (Германия, 2006), микст-инфекции действительно часты – 69% всех случаев выявления недерматомицетов, последние были изолированы в 32% всех случаев онихомикоза. В 10% всех случаев онихомикоз был вызван недерматомицетами в качестве самостоятельных патогенов, причем у подавляющего большинства больных – дрожжеподобными грибами16.
Scher R et al. (США, 2007), несмотря на убедительные данные ряда эпидемиологических исследований (в том числе и в США), лишь осторожно замечают, что “Candida albicans иногда является патогеном при поражении ногтей кисти, и клиническая корреляция является решающим фактором диагностики ”1, т.е. рассматривают Candida в качестве скорее оппортунистического, условно-патогенного возбудителя. С другой стороны, авторы обзора предлагают для Scytalidium dimidiatum и S. hyalinum те же критерии диагностики, что и для дерматомицетов, стало быть, рассматривают их в качестве достаточно вирулентных, самостоятельных патогенов; для других плесневых грибов (ряд видов Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Onychocola, Scopulariopsis) рекомендуют повторное культуральное выявление в ряду последовательных заборов материала при обязательной корреляции с результатами прямой микроскопии и клиническими признаками1. Любопытно, но в 2001 году Scherer W et al., обследовали 450 пожилых людей (geriatric population) Южной Флориды (тропический климат): 56% онихомикозов были вызваны плесневыми грибами, 19% – дрожжеподобнымиSchererW. Едва ли большинство бодрых американских стариков выраженно иммуносупрессировано или страдает перемежающейся хромотой. По данным Elewski В, только около 5% онихомикозов кисти в США вызвано Candida 4. В ряде климатогеографических областей, тем не менее, отмечают определенно существенное значение Candida в этиологической структуре онихомикозов стоп, а не только кисти, например, в Саудовской Аравии, где Candida spp. являются вторым по частоте после T. mentagrophytes патогеном при онихомикозах (третье место удерживают Aspergillus spp.). Интересно, что онихомикоз вообще является самым частым дерматомикозом в Саудовской Аравии (40,3%)48.
По данным датских исследователей (географическая широта Московской области, климат в Дании – умеренный, влажный, зима теплая, в феврале, в среднем, около 0 градусов по Цельсию) 76% онихомикозов вызваны дерматофитами, 14,4% – Candida albicans, по 4,8% – Trichosporon cutaneum и Scopulariopsis brevicaulis. В 2004 году было скринингово обследовано 5755 человек, различного характера дистрофические изменения ногтей выявлены у 16,5 % обследованных, онихомикоз – у 5%. Типичный портрет больного – мужчина старше 40 лет с дистально-латеральным поражением ногтей стоп. Обследование включало прямую микроскопию, культуральное и гистопатологическое исследования – все двойные слепые, в двух разных микологических лабораториях. Наиболее частыми предрасполагающими онихомикозу причинами были: семейный дерматофитоз (22%), травма (16,9%), сахарный диабет (6,7%), периферическая сосудистая недостаточность (5,9%)SvejgaardEL, NilssonJ. OnychomycosisinDenmark: prevalenceoffungalnailinfectioningeneralpractice. Mycoses. 2004 Apr;47(3-4):131-5..
По данным ретроспективного исследования Mügge C et al., Leipzig, (75% материала составили образцы ногтей стоп, 23% – ногтей кисти, 2% – обе локализации) дрожжи явились причиной 29% всех случаев онихомикоза. Среди дрожжей лидировали C. parapsilosis (42%), C. guilliermondii (20,1%), C. albicans (14,2%), Trichosporon spp. (10%). Плесени вызвали 3% всех случаев онихомикоза, из них в 43% случаев причинным агентом был S. brevicaulis.Mügge C, Haustein UF, Nenoff P. Causative agents of onychomycosis-a retrospective study. JDtschDermatolGes. 2006 Mar;4(3):218-28.
Австрийское ретроспективное исследование выявило впечатляющий рост кандидозных онихомикозов кисти всего за одно десятилетие конца 20 века: с 29% до 52%GinterGetal. [Increasing frequency of onychomycoses—is there a change in the spectrum of infectious agents?]. Mycoses. 1996;39 Suppl 1:118-22. Авторы задаются вопросом о дифференциации, различении колонизации и инфекции в случае изоляции Candida при онихомикозе/ониходистрофии. Они полагают, что роль дрожжеподобных грибов в патогенезе онихомикоза до конца не понята.
Результаты исследования не могут быть признаны достоверными, если на момент взятия материала не истекло по меньшей мере 4 (лучше – 8-12) недель после прекращения системной и местной антифунгальной терапии. При проведении крупных исследований конроль излеченности осуществляется каждые 2 месяца в течение года. Следует отметить, что после курса лечения антимикотиками нередко отсутствует рост грибов в культуре наряду с обнаружением мицелия микроскопически. Следует помнить, что грибковая инфекция распространяется как лесной пожар, поэтому активные жизнеспособные гифы сконцентрированы и могут быть легко обнаружены в области “передового края” инфекции. Для получения адекватных результатов микологического исследования материал следует брать не с поверхности, а из более глубоких и проксимальных (при дистально-латеральной форме) областей поражения (за исключением разве что изолированного поверхностного поражения при поверхностном белом онихомикозе), при Candida онихомикозе – в большинстве случаев в области проксимального/латерального края ногтя. При онихолизе материал должен быть взят из-под ногтевой пластинки. Gupta A, Ryder J и Summerbell R резонно полагают, что диагноз кандидозного онихомикоза не может быть поставлен без обнаружения псевдомицелия Candida в материале ногтя49.
Высокую чувствительность и специфичность имеет способ взятия патологического материала с аспирацией в одноразовый бумажный контейнер при помощи аппарата для медицинского педикюра. Поверхностные слои равномерно удаляются по всей площади, после повторной обработки спиртом забор материала контролируемо производят из глубоких слоев ногтевой пластины/ногтевого ложа, достичь которых может лишь действительно патогенный гриб – благодаря активному инвазивному росту. Hull PR et al. еще в 1998 году опубликовали данные сравнительных исследований: подобная методика забора материала эффективно предотвращает контаминацию и обеспечивает существенный рост частоты позитивных результатов культурального исследования при положительной микроскопии – с обычных 50% до не менее 88%50.
Доставка материала в лабораторию должна осуществляться в стерильном одноразовом контейнере, а не в случайном листке бумаги. Контейнер должен быть герметически закрыт. Материал не должен быть слишком влажным, чтобы избежать быстрого роста бактериальных и грибковых контаминантов, что затрудняет или делает невозможным диагностику. Образцы должны быть в работе не более чем в недельный срок после взятия. Чувствительность микроскопии существенно повышает применение флюоресцентных красителей, например, калькофлуора белого. Для выделения патогенных грибов используют разные среды. Дерматомицеты изолируют на селективных средах, содержащих обычно циклогексимид, угнетающий рост большинства бактерий и плесневых грибов, например, Mycosel TM. Другие среды свободны от циклогексимида, что позволяет выделять и патогенные плесневые грибы (агар Сабуро, среда Литтмана, картофельный агар с глюкозой). Для исключения бактериальной контаминации в среды обычно добавляют гентамицин или хлорамфеникол. Бактериальные инфекции ногтя определяют при помощи универсальных неселективных сред. Референтные лаборатории обязательно должны производить посев материала и на среду с циклогексимидом, и на среду без него, поскольку этиологическое значение плесневых грибов все более возрастает. Антибиотические субстанции, продуцируемые дерматомицетами in vivo, могут приводить к возникновению в области поражения антибиотикорезистентных популяций бактерий, например Staphylococcus aureus. Ингибирование таких бактериальных изолятов может быть затруднительно. Наиболее часто ассоциирован с ними T. rubrum. Наличие таких бактерий нередко блокирует пигментообразование грибов, что может приводить к ошибке их идентификации51,52. Для селективного выделения плесневых грибов с исключением дерматомицетов нередко используют среду Чапека, содержащую сахарозу и нитрат, на которой дерматомицеты не растут. Более строгим подтверждением действительной инвазии патогенного недерматомицета является неоднократное последовательное выделение гриба в культуре из пораженного ногтя при условии такой же серии отрицательных культуральных исследований на дерматомицеты. Микст-инфекция дерматофитов и плесневых грибов встречается, по некоторым данным, в половине всех случаев выявления плесневого онихомикоза
Предварительную идентификацию дрожжеподобных грибов Candida проводят на хромогенных средах, при помощи ассимиляционных (например, Ауксоколор) и ферментационных тестовых систем. Для подтверждения диагноза недерматомицетного плесневого онихомикоза до сих пор широко используют критерий/методику Walshe и English (1966): рост определенного плесневого гриба при инкубации в 5 и более фрагментах пораженного ногтя из 20 на стандартной средеWalshe MM, English MP. Fungi in nails. Br J Dermatol. 1966 Apr;78(4):198-207.. Однако, по данным исследования Gupta А et al. (2001) репрезентативность такого культурального теста составляет для большинства плесневых патогенов не более 23%, не являясь абсолютной (около 90%) даже при росте на всех 20 фрагментах. По мнению Gupta А, наиболее соответствуют методике Walshe и English лишь случаи диагностики онихомикоза, вызванные Acremonium53.
Сложности этиологической диагностики NDF онихомикоза представляются во многом надуманными. При четком соблюдении методологии дифференциальной диагностики – выполнении классического критерия повторного взятия образцов – точность (accuracy) диагностики составляет по меньшей мере 92,7%, точность исключения влияния контаминантов – 100%.SummerbellRCetal.Onychomycosis: a critical study of techniques and criteria for confirming the etiologic significance of nondermatophytes.Med Mycol. 2005 Feb;43(1):39-59.
Положительные результаты микроскопии и культурального исследования в отсутствие ясных клинических признаков онихомикоза могут рассматриваться как свидетельство контаминации или непатогенной колонизации, за исключением, в большинстве случаев, дерматомицетов. В таких сомнительных случаях следует прибегнуть к гистологическому исследованию.
Итак, если диагноз неясен, помимо использования прямой микроскопии с КОН и культуральных методик, может быть предпринято гистологическое исследование (серийных срезов образцов ногтя или измельченного патологического материала). Наибольшей чувствительностью обладает гистологическое исследование биоптатов ногтя, взятых пробойником (диаметром не менее 3 мм); однако в 10-15% случаев после биопсии развивается стойкая деформация ногтевой пластины. Метод ШИК (PAS) окрашивания ряда полисахаридных компонентов клеточной стенки гриба (гифы приобретают ярко-красную окраску) имеет чувствительность не менее 92%54, к тому же позволяет выявить патогенные грибы гораздо быстрее, чем культуральное исследование. Наиболее чувствительна комбинация гистологического исследования и прямой микроскопии – около 98%57. Еще более селективными являются окраски метенамином серебра (по Grocott- Gomori) и калькофлуором белым. Окраска метенамином серебра одними авторами признается менее чувствительной, чем PAS, другими – более. По Grocott препарат предварительно обрабатывают хромовой кислотой, что контрастирует его бледно-зеленым оттенком, черно-коричневый мицелий выглядит несколько иначе, чем при классической окраске Gomori.
В исследовании Grover C. (Дели, Индия) типичные гифы были обнаружены в 14 из 15 случаев (93,3%) при гистологическом ШИК/PAS окрашивании препаратов при отрицательных прямой микроскопии и культуральном исследовании. Чувствительность последнего составила 44%, комбинированная с микроскопией – 86%. Наиболее частым изолятом был T. mentagrophytes20?GroverC, ReddyBS, ChaturvediKU. Onychomycosis and the diagnostic significance of nail biopsy. J Dermatol. 2003 Feb;30(2):116-22.. Данное исследование показывает неоспоримую важность гистологического исследования, которое, по нашему мнению, должно выполняться во всех сомнительных диагностических случаях. Так, например, принято считать, что онихомикозы составляют лишь около половины всех случаев ониходистрофий; однако, по данным гистологических исследований, инвазивные гифы обнаружены в 61% случаев всех дистрофий8. Метод также позволяет различать различные морфологические формы грибковых клеток, в особенности мицелиальные грибы, дрожжи, конидии и спородохии PiérardGE, QuatresoozP, ArreseJE. Spotlightonnailhistomycology. Dermatol Clin. 2006 Jul;24(3):371-4..
Гистологический метод диагностики не подвержен риску контаминации и гораздо быстрее, чем культуральный метод, объективно демонстрирует реальную инвазивность/вирулентность возбудителя, чувствителен даже на фоне лечения антимикотиками, в отличие от прямой микроскопии и, особенно, ПЦРHerbstR, BrinkmeierT, FroschP.
Histological diagnosis of onychomycosis. [Article in German] J Dtsch Dermatol Ges. 2003 Mar;1(3):177-80.. С другой стороны, обычно он не специфичен.
Наиболее выгодна в финансовом отношении (соотношение чувствительность/стоимость окраска хлоразолом черным (chlorazol black E).
Будучи наиболее чувствительным методом диагностики онихомикоза, гистологическое исследование позволяет также ясно увидеть активный характер инвазии гриба в аппарат ногтя, отличный от случайной контаминации или транзиторной колонизации, различать морфологические элементы гриба62.
Взятие патологического материала для гистологического исследования может быть выполнено при помощи аппарата медицинского педикюра с дальнейшей обычной гистологической проводкой (парафин, нарезка, окрашивание, микроскопия). По ряду данных, например Chang A et al. (2007)63, нет настоятельной необходимости биоптировать ноготь пробойником, достаточно исследовать подногтевой детрит и гиперкератоз (ногтевое ложе): в 97% случаев обнаруживается мицелий, лишь в 3% случаев мицелий выявляют только в самой пластине. По нашему мнению, грамотное взятие материала фрезой позволит разрешить если не все, то большинство “проклятых” вопросов диагностики онихомикозов. Материал забирается из разных мест ногтя.
Итак, при ониходистрофиях сомнительного генеза по гистологической картине серийных срезов можно однозначно отличить инвазивный характер поражения от простой колонизации подногтевого материала. Родовая и видовая идентификация мицелиальных грибов, однако, обычно невозможна. В ряде случаев опытный врач-лаборант по ряду характерных особенностей может составить предположение о видовой принадлежности гриба, например, спорулирующего (преимущественно в трещинах и пустотах ногтя) Scopulariopsis brevicaulis – благодаря характерной форме конидий, напоминающих лимон, или филаментов Scytalidium spp. – по особого вида толстым гиалиновым клеточным стенкам. Для Fusarium spp., равно как и для Aspergillus spp., характерно ветвление мицелия под острым углом.
Детекция патогенных грибов при помощи ПЦР имеет ряд существенных особенностей. Еще в 2003 году на Конгрессе дерматологов Menotti J сообщил о 93% чувствительности ПЦР в диагностике дистально-латерального типа онихомикоза, вызванного дерматомицетами или Scytalidium. С другой стороны, в исследовательском докладе Walberg M. et al. (2006) указывается, что в ряде случаев ПЦР (18-S) недостаточно чувствительна (иногда отрицательна при положительном культуральном исследовании, или невозможно определить возбудитель до вида)64
По данным японских исследователей, уровень идентификации дерматофитов конвенциальными методами довольно низок. Более того, клинические изоляты иногда обнаруживают атипическую морфологию, и в этих случаях микроскопия для идентификации неприменимаUchidaTetal. Comparative study of direct polymerase chain reaction, microscopic examination and culture-based morphological methods for detection and identification of dermatophytes in nail and skin samples. JDermatol. 2009 Apr;36(4):202-8.. Еще в 2005 году nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS)1 DNA sequence специфичная ПЦР, использованная для идентификации T. rubrum и T. mentagrophytes в изолятах и клиническом материале (126 – кожные чешуйки, 80 – ногти), показала превосходную чувствительность – 100%, 100%; 95% и 99% положительных результатов, соответственно. Против 67% положительных результатов посева кожных чешуек и 33% – материала ногтей! Удивительно, но исследование выполнялось в рядовой японской больнице (Kawasaki Social Insurance Hospital)UchidaTetal. Comparative study of direct polymerase chain reaction, microscopic examination and culture-based morphological methods for detection and identification of dermatophytes in nail and skin samples. J Dermatol. 2009 Apr;36(4):202-8..
В исследовании материала ногтей от 550 лиц с заподозренным онихомикозом Litz C, Cavagnolo R. Polymerase chain reaction in the diagnosis of onychomycosis: a large, single-institute study. BrJDermatol. 2010 Sep;163(3):511-4. PAS, PCR, KOH и культуральное исследование были позитивны, соответственно, в 54%, 37%, 40% и 22% случаев. Комбинация KOH и PCR дала позитивный результат в 52% случаев.
Garg J et al. (2007) предлагают рассматривать гнездовую (nested) пандерматомицетную ПЦР в качестве золотого стандарта диагностики онихомикозов, вызванных дерматомицетами65: даже на фоне антимикотической терапии гнездная ПЦР, использующая две пары ПЦР-праймеров вместо одной в отношении каждого локуса ДНК, безошибочно детектирует присутствие ДНК искомого гриба в исследуемом материале64.
Мультицентровое тестирование коммерческого диагностического набора Onychodiag (BioAdvance, Франция, 2007) показало 100% специфичность диагностикума при усредненной чувствительности в 83,6% при взятии материала наиболее проксимально/близко к очагу поражения (87,9% при считывании и “серой” зоны) или 92,0% при дистальном способе забора – из клипированной ногтевой пластинки66.Нельзя не отметить отличие (возможно, мнимое) от данных Harvey C. и Richardson A. (Калифорнийский колледж подиатрической медицины, 2000), оценивших различия в чувствительности разных методов забора патологического материала для культурального исследования: культуры, полученные из подногтевого детрита были чаще позитивны на дерматомицеты, плесневые и дрожжеподобные грибы, чем из материала более глубоких слоев ногтевого ложа или только ногтевой пластины67.
Следует подчеркнуть тот факт, что при ПЦР полученные результаты в ряде случаев являются ложноположительными клинически, поскольку может быть детектирована ДНК и нежизнеспособных гиф мицелиальных грибов или мицелиальных форм дрожжеподобных грибов, или же может быть определено наличие ДНК почкующихся дрожжеподобных грибов в отсутствие активного инвазивного мицелия. Жизнеспособные элементы гриба могут быть отличительно визуализированы при помощи методов витальной окраски, например, нейтральным красным или определенными флуорохромами, например, диацетатом флюоросцеина, существенно абсорбируемого только активными клетками гриба.
Итак, очевидно, что ориентация только на данные ПЦР (в том числе мультиплексной ПЦР, пандерматомицетной ПЦР), в особенности – чувствительной и высокоспецифичной гнездовой (со вложенной парой праймеров) ПЦР, в ряде случаев не может быть оправдана клинически. Результаты ПЦР не могут рассматриваться в качестве самостоятельного диагностического критерия, равно как и критерия неизлеченности при положительном результате – в отсутствие культурального и микроскопического подтверждения.
По мнению швейцарских исследователей (2006), при росте плесневых грибов в культуре, но отрицательном генетическом типировании (т.е. недостаточно генетического материала) плесеней следует думать о вероятной контаминации мицелиальным недерматомицетом (в таких случаях ПЦР часто детектирует присутствие дерматомицета, обычно – T. rubrum). Чаще всего это – Penicillium spp. и Alternaria spp.17 Отрицательный результат ПЦР-диагностики также может быть следствием недостаточного количества исследуемого материала, как такового. Это недавнее трехлетнее (2003-2005) исследование Monod M. et al вообще заставляет по новому взглянуть на вопрос о самостоятельной патогенности недерматомицетов (включая Candida). В диагностике использовали одновременно прямую флюоресцентную микроскопию, культуральный метод и ПЦР (sequencing/RFLP). Строго показано, что недерматомицетные грибы (NDF) выявлены в ~30% всех случаев онихомикоза (не включая микст-инфекции). Исследователи считают, что Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis и различные виды Acremonium, Aspergillus (в особенности Aspergillus flavus и Aspergillus versicolor), Penicillium, Alternaria, Curvularia, Mucor и дрожжеподобные Candida могут выступать в роли самостоятельных этиологических агентов при онихомикозе. Fusarium spp. изолированы в 4% случаев. Авторы, кажется, сами удивлены полученными результатами и даже приводят недавние данные другой исследовательской группы (Kardjeva et al.,2006), проводившей ПЦР-диагностику образцов, взятых у больных онихомикозом в Болгарии и Греции – всего 4% позитивных на NDF от 100% положительных при прямой микроскопии68.
Полагаем, что для разрешения всех недоумений и определения истинной этиопатогенетической роли недерматомицетов следует провести исследование, подобное выполненному в Лозанне группой Monod, но дополнить его панч-биопсией с последующим гистологическим/гистохимическим исследованием. Иначе в проблеме не разобраться еще весьма долго.
Monod M. также сравнивает ПЦР и культуральный метод по показателю стоимость/эффективность: вчетверо более дешевый, культуральный метод дает 40% ложноотрицательных результатов17.
В крупных лабораториях иногда применяют иммуногистохимические методики (особенно полезны при микст-инфекциях, для визуализации обычно используют иммунофлуоресценцию, иммунопероксидазный или авидин-биотиновый методы) и проточную цитометрию. Используется и масс-спектрометрия (matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry – MALDI-TOF MS) – быстрый, точный и дешевый в отношении расходных материалов метод; исследование занимает всего несколько минут. Определение вида гриба происходит по соответствию показателям референтных штаммов из компьютерной базы данныхErhard M et al. Identification of dermatophyte species causing onychomycosis and tinea pedis by MALDI-TOF mass spectrometry. Exp Dermatol. 2008 Apr;17(4):356-61.. Конфокальная микроскопия может быть быстрым и надежным методом диагностики онихомикоза in vivo, однако ее возможности различения дерматомицетов и плесневых грибов пока еще весьма ограничены. Точная идентификация возбудителя может иметь существеннейшее значение, поскольку патоген может быть резистентен к терапии антимикотиком, выбранным клиницистом.
Нельзя не приветствовать решения 4-ой научной конференции Nordic Society for Medical Mycology (2007)41, обозначившей перспективные задачи микологической диагностики: трехмерное (3D) гистологическое исследование, например, конфокальная микроскопия; молекулярная идентификация; определение энзиматической активности (в том числе и методами функционального генетического типирования); точное определение чувствительности к антимикотикам.
Очевидно, что важнейшей задачей является разработка методов быстрой, недорогой, легко воспроизводимой идентификации всех грибковых патогенов и быстрых, недорогих тестов для определения вирулентности и резистентности к антимикотикам выделенных в конкретном случае возбудителей.
Необходимо четко определить границы репрезентативности тех или иных диагностических тестов, в том числе в отношении оценки контаминации, выработать строгие алгоритмы комбинации диагностических исследований и проведения повторных тестов.
Академическая дерматологическая школа по традиции довольно резко отвергает саму возможность первичного поражения ногтей дрожжеподобными грибами. Однако, результаты независимых исследований, проведенных в наших же широтах, не противоречат такой возможности. По нашему мнению, для более точного выяснения истинных патогенных потенций дрожжеподобных и ряда плесневых грибов следует неукоснительно следовать известным критериям диагностики. Следующие критерии позволят прекратить бесплодные дискуссии о предположительной контаминации и условной патогенности, границы которой не определены сколько-нибудь ясно:
(1) подтверждение не только прямой микроскопией, но гистологическим исследованием, единственно способным показать истинные вирулентные потенции гриба
(2) культуральная и генетическая (ПЦР) детекция в серийных, правильно взятых образцах
(3) отрицательный результат повторных исследований на присутствие в патологическом материале дерматомицетов*
(4) ясные клинические признаки и особенности инфекции
(5) контрольные исследования группы здоровых лиц (представление о характере и уровне контаминации в данном регионе)
(6) оценка возможных механизмов инвазии (например, динамическое определение экспрессии генов кератинолитических энзимов)
*Вопросы лабораторной и клинической оценки микст-инфекций при онихомикозах разработаны мало, поэтому критерий отсутствия обнаружения дерматомицетов (также в серийном исследовании) для подтверждения недерматомицетной природы поражения на данном этапе представляется правильным.
Представляется, что только таким образом можно получить статистически достоверные эпидемиологические данные для данного региона и далее ориентироваться на них при оценке каждого конкретного диагностического случая.
Важная задача дальнейших исследований этиопатогенеза онихомикоза – изучение функциональной биологии грибов in vivo без отрыва от важных, ключевых для развития и поддержания инфекционного процесса особенностей анатомии, физиологии и биохимии ногтя как мозаичной морфофункциональной системы. Очевидно, что этиологические различия разных клинических типов поражения предполагают существование в ногте отличных физиологических/биологических ниш для развития грибковой инфекции. Полагаем также, что одной из задач научного поиска должно быть определение иных, чем кератин, источников питания грибов. Различия ферментных систем и прикрепительных свойств грибов могут являться ключом к пониманию особенностей эпидемиологии и этиопатогенеза онихомикоза. С другой стороны, пристальное внимание следует уделить изучению тонких генетических, иммунологических и метаболических особенностей организма-хозяина, предполагающих повышенную склонность к инфицированию.
Также следует отметить, что несмотря на многочисленные исследования, не проведено вполне определенной родовой и видовой диверсификации патогенов при онихомикозе стопы versus онихомикозе кисти. Необходимы глубокие исследования, четко и недвусмысленно установившие бы истинные факторы патогенности и вирулентности дрожжеподобных и плесневых грибов при онихомикозе – относительно простыми, воспроизводимыми методиками.
Итак, можно резюмировать, что в клинической эпидемиологии онихомикоза в настоящее время наблюдается болезненная смена самой научно-методологической парадигмы, клинико-диагностической идеологии практической микологии – на фоне определенно усиливающихся патогенных свойств недерматомицетов происходит и научно-техническая революция средств диагностики. Консервативный взгляд на онихомикоз как вотчину безраздельно господствующих дерматомицетов постепенно сменяется на более взвешенный, конструктивный подход, определяемый принципами доказательной медицины69, а не медицины школ и мнений.
Однако и само проведение крупных рандомизированных контролируемых исследований, (основания медицины доказательной) по данной проблематике весьма затруднительно ввиду едва ли возможной практически строгой стандартизации диагностических методов и критериев оценки нередко антиномичных данных, полученных разными методами (прямая микроскопия, культуральное исследование, ПЦР) – в эпоху смены научной парадигмы в практической микологии.
